从生物合成法和化学合成法两个方面综述了多肽的合成,对氨基酸的羧内酸酐(NCA)法、液相分段合成法、组合化学法、酶解法、基因工程法、发酵法等进行了评述,概述了多肽在多肽药物、多肽药物载体、组织工程材料及多肽营养食品方面的应用,并对我国多肽产业的发展前景进行了展望。
关键词:多肽合成;多肽药物;药物载体;组织工程;营养食品;多肽产业
中图分类号:TQ 464.7 Q 51 文献标识码:A 文章编号:1672-5425(2010)04-0009-06
多肽是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,由一种或多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。多肽是构成蛋白质的结构片段,也是蛋白质发挥作用的活性基团,是人体进行代谢、调控活动的重要物质。蛋白质主要以多肽形式吸收,透过多肽既可深入研究蛋白质的性质,又为改变和合成新的蛋白质提供了基础材料。研究多肽结构与功能的关系,有助于了解多肽中各氨基酸系列的功效,以便应用中设计尽可能短的多肽同时提高其生理活性,减少临床的不良反应。随着美国FDA1999年开始允许大豆蛋白制品标注可以预防心血管疾病的功能和人们对多肽中各氨基酸系列的功效的不断了解,作为药物和营养品的多肽产品不断被开发出来,多肽的研发已成为近年生命科学研究的一大热点[1~7]。
1 多肽的合成
1.1 多肽合成的分类
多肽的合成主要有两条途径:化学合成和生物合成。化学合成主要通过氨基酸缩合反应来实现。为得到具有特定顺序的合成多肽,当合成原料中含有官能度大于2的氨基酸单体时,应将不需要反应的基团暂时保护起来,然后再进行连接反应,以保证合成的定向进行。
多肽的化学合成有固相合成和液相合成之分,其主要的区别在于是否使用固相载体。多肽液相合成主要有逐步合成和片段组合两种策略,逐步合成简洁迅速,被用于各种生物活性多肽片段的合成;片段组合法为合成含100个以上氨基酸的多肽提供了最有前途的路线,并已成功地合成了多种有生物活性的多肽,其最大的特点是易于纯制。1963年,Merrifield创立了固相合成法,将氨基酸的C末端固定在不溶树脂上,然后在此树脂上依次缩合氨基酸、延长肽链。固相合成法又可分为Boc(叔丁氧羰基)法和Fmoc(9-芴甲基氧羰基)法。在传统液相和固相合成多肽方法的基础上,人们又发展了氨基酸的羧内酸酐(NCA)法、液相分段合成法、组合化学法等。
在生物合成多肽方面,除了常用的发酵法、酶解法外,随着生物工程技术的发展,DNA重组技术也被应用于合成多肽。
1.2 氨基酸的羧内酸酐法[8,9]
氨基酸的羧内酸酐是氨基酸的一种衍生物,它的氨基保护基也活化羧基。NCA法属于阴离子开环聚合机理,其引发剂可选用多种亲核试剂或碱类。采用NCA法合成多肽的基本反应包括:在碱性条件下,氨基酸阴离子进攻NCA形成较为稳定的氨基甲酸根离子,在酸化时该离子失去二氧化碳生成二肽。生成的二肽又进攻其它的NCA,如此反复进行下去(图1)。


 
NCA法具有合成周期短、操作简单、成本较低、产物分子量高等优点,在目前多肽合成中所占比例较大,技术也较为通用。但是,采用NCA逐步法只能合成短链多肽片段[9]。
1.3 液相分段合成法[10~19]
液相分段合成法是多肽片段在溶液中依据其化学专一性或化学选择性,自发连接成长肽的合成方法,其优点是能得到长肽,但技术还不完善。常用的连接技术主要有:天然化学连接[11]、化学区域选择连接[12,13]、可去除辅助基连接[14]、光敏感辅助基连接[15]、施陶丁格连接[16,17]和正交化学连接[18,19]。
天然化学连接方法(图2)是以C端为硫酯的多肽与N端为半胱氨酸(Cys)残基的多肽反应得到以Cys为连接位点的多肽。由于连接所合成的多肽必须含Cys残基,限制了该方法的应用。


 
化学区域选择连接方法(图3)是以2-巯苄基作为辅助基与硫酯反应。加快了缩合速度,辅助基易脱除,且去除辅助基连接是以苯胺的衍生物NA-(1-苯基-2-巯乙基)为辅助基团,对强酸保持稳定,使得N端多肽片段较易合成。


 
光敏感辅助基连接方法(图4)是以NA-2-巯基-1-(2-硝基苯)乙基为辅助基(见光分解易脱除)合成多肽的。


 
施陶丁格连接方法(图5)是以叠氮反应为基础,以C端的膦硫酯和N端的叠氮化合物反应生成酰胺膦盐,酰胺膦盐水解得到多肽和膦氧化物。


 
正交化学连接方法是改进的施陶丁格连接方法,通过简化膦硫酯辅助基来提高片段间的缩合率。1.4 组合化学法[20~25]
组合化学法是20世纪80年代在固相多肽合成的基础上发展起来的。它将氨基酸的构建单元按某种组合方式连接起来,合成出包含大量化合物的化学库,并从中筛选出具有某种物理、化学或药理活性化合物的一套合成策略和筛选方案。与传统合成方法不同的是,传统合成方法一次只合成一种化合物,而组合化学法可同时合成多种化合物。常用的合成策略方法主要有:混合-均分法、迭代法、光控定位组合库法、茶叶袋法[21]等。Dubs等[25]利用化学选择平行方法,得到了含有102种两亲性黑色素细胞刺激素(R-MSH)的类似物的肽库。经药理测试发现,其中84种化合物的AMPs的诱导性高于已应用的R-MSH促效剂Melitane。
组合化学法能最大限度地筛选各种新化合物及其异构体,从而首先找到具有药效作用的先导物,是世界各大医药公司普遍采用的方法。目前面临的问题是:如何提高合成化合物组合库的分子多样性和开发与之配套的敏感有效的快速分析和鉴定手段。
1.5 酶解法[26,27]
用酶解法合成多肽,又称酶法多肽,就是用生物酶降解蛋白质,将动植物大分子蛋白质降解成小分子活性多肽。酶解蛋白质所用的酶,大多数是肽酶类。近年来,人们运用酸、碱降解蛋白质获得多肽收获甚微,固定投资大,周期长,污染严重,风险大,未能实现工业化生产。武汉九生堂的邹远东教授利用酶解法开发出大豆多肽、大豆寡肽、鲍鱼肽[26]、海参肽、苦瓜肽[27]、鱼翅肽、燕窝肽等一系列多肽产品,在酶法多肽方面做出了杰出贡献。酶法多肽具有以下优点:酶解不降低蛋白质的营养价值,可获得比原食品蛋白质更多的功能;可保持多肽营养纯天然绿色属性,不含化学物质等。但酶解得到的是一系列多肽,分离纯化难度较大,因此不适于合成单一的多肽。另外,肽酶的催化具有专一性,因此,寻找合适的肽酶也是该方法的一个难点。
1.6 基因工程法[28]
DNA重组技术的诞生为合成序列确定的多肽奠定了基础,即可通过设计合适的DNA模板来控制多肽的序列。利用DNA重组技术,可以通过重组DNA产生的工程菌来大量高效地合成多种生物活性多肽。Urry等在大肠杆菌中表达了似弹性蛋白--聚缬氨酸-脯氨酸-甘氨酸-缬氨酸-甘氨酸肽(VPGVG),是基因工程技术应用于多肽合成的范例。利用基因工程技术生产的活性多肽还有肽类抗生素[28]、干扰素类、白介素类、生长因子类、肿瘤坏死因子、人生长激素、凝血因子、促红细胞生成素、组织非蛋白纤溶酶原等。基因工程法合成多肽具有表达定向性强、产品安全卫生、原料来源广泛和成本低等优点,可以得到质量高、疗效好且具有天然活性的多肽类药物,但存在高效表达等技术难题,分离困难,产率低,成本昂贵,难以用于规模生产。
1.7 发酵法[29]
发酵法是从培养的微生物产生的代谢产物中提取多肽的方法。目前,微生物能够独立合成的聚氨基酸只有E-聚赖氨酸(E-PL)、C-聚谷氨酸(C-PGA)和聚(L-精氨酸-L-天冬氨酸)(蓝细菌肽)。发酵法的优点是工业化成本低,但是产物范围窄,且产物提纯复杂。